Perteklinių embrionų po pagalbinio apvaisinimo procedūrų šaldymas. Vitrifikacija

Įvadas

  Krioišlaikymas (angl. cryopreservation) yra užšaldytų audinių ir ląstelių išlaikymas ilgą laiką siekiant juos panaudoti ateityje. Panaudojus šiuoalikines technologijas įmanoma užšaldyti pavienes ląsteles (pvz., spermatozoidus, kiaušialąstes ir embrionus), nedidelius audinio gabalėlius (pvz., sėklidės ar kiaušidės audinys) ar organus. Krioišlaikymas dažniausiai naudojamas transplantologijoje (organų ir audinių užšaldymas), taikant nevaisingumo gydymo technologijas (spermatozoidų, kiaušialąsčių, embrionų, sėklidės ar kiaušidės audinio užšaldymas), kuriant įvairius audinių bankus. Gydant nevaisingumą dažniausiai šaldomi likę po patalpinimo, vadinamieji „pertekliniai“ embrionai, kuriuos pora norėtų panaudoti ateityje.

Nevaisingumo problema

  Pasaulyje vis daugiau porų diagnozuojami įvairūs vaisingumo sutrikimai arba nevaisingumas. Nustatyta, kad kas šešta pora, t. y. 10–15 proc., susiduria su pirminiais vaisingumo sutrikimais, o apie 10–25 proc. moterų patiria antrinį nevaisingumą, t. y. negali pastoti pakartotinai. Manoma, kad Lietuvoje šiuo metu yra apie 50 tūkst. nevaisingų porų, o kiekvienais metais jų padaugėja maždaug 2 tūkst. Nevaisingumo problema aktuali ir moterims, ir vyramas. Moterų nevaisingumas sudaro 30–40 proc., vyrų – 10–30 proc., abiejų partnerių – 15–30 proc. ir neaiškios kilmės nevaisingumas apie 5–10 proc. Tačiau pastebėtina, kad nevaisingumo priežastys pastaruoju metu kinta. Jei anksčiau nevaisingumas moterims pagrinde buvo diagnozuojamas dėl kiaušintakių nepraeinamumo, endometriozės, plicistinių kiaušidžių sindromo, o vyrams įgimta ar įgyta oligoastenospermija (spermatozoidų skaičiaus ir judrumo sumažėjimas), tai dabar vis dažniau nevaisingumo priežastys yra nenustatomos. Specialistų nuomone, šiems procesams didelės įtakos turi šeimos planavimo vėlinimas, kuomet pora ilgai saugosi nėštumo dėl karjeros ar geresnės materialinės situacijos, ir su tuo susiję nuolatiniai stresai, įtampa, netaisyklinga mityba. Nemažą įtaką turi ir aplinkos užterštumas. Visame pasaulyje, o ir Lietuvoje, gausėja nutukusių ir turinčių viršsvorį žmonių. Nutukusioms moterims pasireiškia ovuliacijos sutrikimai ir su tai susijęs nevaisingumas [1].

Pagalbinio apvaisinimo procedūros

  Vaisingumo sutrikimų ar nevaisingų porų gydymo metodo parinkimas priklauso nuo tyrimais nustatytos nevaisingumo priežasties. Daliai nevaisingų šeimų gali padėti gydymas vien medikamentais (pvz., esant neryškiems ovuliacijos sutrikimams, gydant užleistas infekcines ligas). Tačiau gydymas vien vaistais nepadės ryškius vaisingumo sutrikimus turinčioms poroms. Tuomet yra taikomi sudėtingesni pagalbinio apvaisinimo būdai (PAB) [1].

Intrauterinė inseminacija (intrauterine insemination, IUI) – tai apvaisinimas moters kūne, in vivo. IUI – tai specialiai paruoštos spermos įšvirkštimas per specialų ploną kateterį į moters gimdą, aplenkiant gimdos kaklelį. Būtina IUI sąlyga – pratekami kiaušintakiai.

  Apvaisinimas mėgintuvėlyje (in vitro fertilization, IVF) atliekama tais atvejais, kai yra pakenkti arba nepratekami kiaušintakiai, kitos moters nevaisingumo priežastys, o vyro spermos tyrimas yra normalus. Pirmieji sėkmingai šį metodą pritaikė britai ginekologas R. Steptoe ir embriologas P. Edwards [1, 2]. 1978 m. gimė pirmasis kūdikis iš mėgintuvėlio – Louise Brown . IVF esmė – ovuliacijos stimuliacijos metu siekiama subrandinti nuo kelių iki keliolikos folikulų. Punktuojant subrendusius folikulus, gaunamos kiaušialąstės. Laboratorijoje atliekamas kiaušialąsčių apvaisinimas, specialiame inkubatoriuje auginami embrionai, kurie vėliau patalpinami atgal į moters gimdą.

Intracitoplazminė spermatozoido injekcija (intracytoplasmic spermatozoid injection, ICSI) – atliekama tais atvejais, kai yra ryškūs vyro vaisingumo sutrikimai, t. y. randami vos keli spermatozoidai, kurie nepajėgūs patys apvaisinti kiaušialąstės. Ypač sunkiais vyro nevaisingumo atvejais spermatozoidų nerandama ejakuliate, tuomet jų ieškoma sėklidės audinyje – atliekama transepiderminė spermatozoidų aspiracija (transepidermal spermatozoid aspiration, TESA) tiesiogiai iš sėklidžių. ICSI metu vienas spermatozoidas, naudojant mikroinjekcinius kapiliarus, injekuojamas į kiaušialąstę. 1978 m. pasaulyje gimė pirmasis IVF kūdikis Louise Brown [2, 3]. PAB procedūrų metu dažnai sukuriama ir vystosi ne vienas, o daugiau embrionų. Didesnis embrionų skaičius reikalingas, siekiant atrinkti potencialiai gyvybingiausius, geriausios kokybės embrionus ir patalpinti juos į moters gimdą. Tačiau tuomet iškyla problema – ką daryti su likusiais embrionais? Daugelyje pasaulio IVF laboratorijų yra šaldomi pertekliniai embrionai.

Istoriniai duomenys

  Pirmą kartą embrionai buvo užšaldyti 1972 m., naudoti laboratorinių gyvūnų embrionai. Užšaldymo procesas truko ilgą laiką, šaldymas buvo atliekamas iš lėto (1 laipsnis per minutę iki -800 C). Užšaldyti embrionai buvo patalpinti į skystą azotą. Embrionų atšildymas taip pat truko ilgą laiką, pastoviai pridedant tam tikrą kiekį krioprotektorių.. Dauguma tyrimų buvo atlikta su pelių embrionais. Užšaldžius ir atšildžius pelių embrionus nebuvo pastebėta ženklių šaldytų embrionų gyvybingumo skirtumų palyginti su nešaldytais (šviežiais). Tačiau to negalima pasakyti apie žmogaus embrionus. Apie pirmą nėštumą po užšaldytų ir atšildytų žmogaus embrionų patalpinimo pranešė Trounson ir Mohr 1983 m. [4]. Vitrifikacijos metodas sukurtas 1987 m. Vašingtone ir ištobulintas Japonijoje Kato moterų klinikoje [5]. 1999 m. gimė pirmas kūdikis atšildžius ir patalpinus žmogaus embrionus po vitrifikacijos [6]. Tyrimai vis tęsiami, tobulinami užšaldymo ir atšildymo protokolai, ieškoma vis naujų krioprotektorių. Tikėtina, kad ateityje pastojimo dažnis ir gyvų naujagimių skaičius po atšildytų embrionų patalpinimo bus toks pats kaip ir po IVF ar ICSI procedūros.

Embrionų užšaldymas ir krioišlaikymas

  Embrionų užšaldymas ir krioišlaikymas – tai yra toks būdas, kai embrionai yra paruošiami terpėse su tam tikromis apsauginėmis medžiagomis (krioprotektoriai) ir laikomi skystame azote ilgą laiką [1]. Tokius užšaldytus embrionus galima vėl atšildyti, o išlikusius gyvybingus patalpinti į moters gimdą. Embrionai atšildomi ir talpinami tuomet, kai nepasiseka atlikta PAB procedūra (moteris nepastojo), arba, esant sėkmingai procedūrai, galima juos išlaikyti ilgesnį laiką ir patalpinti norint susilaukti kito vaikelio.

  Šiuo metu pasaulyje taikomi du užšaldymo metodai – įprastinis, lėtas užšaldymas, ir naujas, super greitas metodas, vitrifikacija [7].

Taigi, šiuo metu pasaulyje naudojami du pagrindiniai užšaldymo metodai:

    Lėtas užšaldymas (angl., slow freezing) – embrionų užšaldymas, kai tirpalas virsta kieta medžiaga formuojantis ledo kristalams;

    Vitrifikacija (angl. vitrification) – embrionų užšaldymas, kai tirpalas virsta kieta medžiaga, dėl super greito užšaldymo laiko, be ledo kristalų formavimosi.

   Naujausių tyrimų duomenimis, naudojant vitrifikacijos metodą, gaunami rezultatai geresni (kai kuriais atvejais net labai ženkliai) nei naudojant tradicinį lėto užšaldymo metodą (1 lent.). Pastaruoju metu vitrifikacijos metodas vis plačiau diegiamas pasaulio IVF laboratorijose.

  Užšaldymui naudojamas skystas azotas, embrionai laikomi -196ºC temperatūroje, kai ląstelėse biologiniai procesai visiškai sustoja. Ši skystojo azoto savybė naudojama norint išsaugoti žmogaus gametas, embrionus ar lytinių liaukų audinius. Užšaldymas atliekamas pagal specialią metodiką naudojant ląsteles apsaugančius krioprotektorius ir tam skirtą aparatūrą (lėtas šaldymas) arba jos nenaudojant (vitrifikacija).


1 lentelė. Užšaldytų ir atšildytų žmogaus embrionų funkcijų palyginimas:

RodikliaiLėto užšaldymo metodu užšaldyti embrionaiVitrifikacijos metodu užšaldyti embrionai
Embrionų išgyvenamumas50,0-57,0%88,0–95,0%
Embrionų dalijimasis30,0–48,0%65,0–78,0%
Implantacijos dažnis7,3–30,0%15,0-33,0%
Nėštumo dažnis10,2-18,0%36,4–49,0%

Pastaba: Lentelėje pateikti apibendrinti Švedijos, Vokietijos, Belgijos, Čekijos, Prancūzijos rezultatai.

Nors abu metodai turi svarbią reikšmę – skirti ląstelių užšaldymui, naudojant skystą azotą, tačiau labai svarbūs yra ir šių metodų skirtumai, pateikti 2 lentelėje.

2 lentelė. Lėto užšaldymo ir vitrifikacijos metodų palyginimas

Lėto užšaldymo metodasVitrifikacija
Užšaldymo pobūdisLėtasSuper greitas
Atšildymo pobūdisLėtasGreitas
Laikas, reikalingas užšaldymo procedūrai≥180 min.2 s
Ledo kristalų formavimasisTaipNe
Speciali aparatūraReikalingaNereikalinga

  Taigi, vitrifikuojant embrionus, užšaldymas ir atšildymas vyksta labai trumpą laiką, o lėtai šaldant, procesas gali užtrukti nuo 90 min. Iki 5 valandų. Taip pat svarbu pažymėti, kad, vitrifikuojant embrionus, nereikalinga papildoma brangi įranga.

   Svarbiausias pranašumas vitrifikacijos metu, skirtingai nuo lėto šaldymo – šaldomas embrionas virsta į stiklą panašios struktūros („sustiklėja“), t.y. šio proceso metu nesiformuoja ledo kristalai. Pridėjus krioprotektorių, ląstelėje esantis vanduo šaldomas iki stiklo struktūros be jokių ledo kristalų formavimosi. Tai ypač svarbu šaldant embrionus, nes ledo kristalai gali pažeisti embrioną (ar kitas šaldomas ląsteles, audinius bei organus). Vitrifikuoti embrionai, vėliau juos atšildžius, pasižymi ženkliai geresniu išgyvenamumu, juos patalpinus žymiai dažniau nustatomas nėštumas moterims ir gimsta didesnis procentas gyvų naujagimių (t.y. rečiau įvyksta persileidimas), palyginti su lėto užšaldymo metu užšaldytais ir atšildytais embrionais [7-9].

    Apibrėžiant vitrifikaciją, galima sakyti, kad tai yra skysčio kietėjimas (stiklo formavimasis) žemoje temperatūroje be ledo kristalų formavimosi, naudojant labai mažus kiekius krioprotektorių ir šaldant dideliu greičiu.

 Užšaldymo technika

   Į tirpalą, kuriame šaldomi embrionai, yra dedama kriopeotektorių. Krioprotektoriai būna dviejų tipų: prasiskverbiantieji (skverbiasi į ląstelės vidų, pvz., propandiolis) ir ekstraląsteliniai (būnantys ląstelės išorėje, pvz., sukrozė ir lipoproteinai).

   Krioprotektoriai naudojami, nes jie:

    -Sumažina užšalimo temperatūrą ir apsaugo nuo ledo formavimosi ląstelių viduje, esant labai žemai temperatūrai.

    -Sąveikaudami su ląstelių membranomis apsaugo jas, kintant jų struktūrai iš skystos į kietą.

   Embrionai, gauti IVF metu, gali būti užšaldomi keliose stadijose. Jie gali būti šaldomi probranduolių (viena ląstelė) arba bet kurioje kitoje stadijoje, kai pradeda dalintis ir virsta blastocista (5-7 dienos po IVF apvaisinimo). Tačiau skirtingų stadijų embrionams yra naudojami skirtingi krioprotektoriai. Pažangios technologijos pažengė labai toli nuo to laiko, kai 1983 m. buvo užšaldyti pirmieji embrionai. Vitrifikacija, kaip pažangiausias šaldymo metodas, tampa vis populiaresne šaldymo technologija pasaulio IVF laboratorijose. Vitrifikacijos protokolai labai paprasti naudoti ir įdiegti į praktiką, embrionai ir kiaušialąstės yra tiesiogiai nardinamos į kriopreotektorius, o vėliau tiesiogiai nardinamos į skystą azotą.

   Tačiau pažymėtina, kad pastojimo dažnis po atšildytų embrionų patalpinimo labai įvairuoja ir dažnai priklauso nuo embrionų užšaldymo būdo. Vienais būdais užšaldant ir atšildant embrionus (pvz., lėtas užšaldymas) pastojimo dažnis siekia vos 10-15 proc., tuo tarpu naudojant kitus užšaldymo būdus (pvz., vitrifikacija) pastojimo dažnis padidėja iki 35 proc. Nėštumo dažnis po natūralaus IVF ciklo taip pat svyruoja (apie 30-40 proc.), o kai kuriose klinikose siekia net 50 proc.

 Baltijos ir Amerikos klinikos IVF laboratorijos patirtis

   2007 m. kovo mėnesį Baltijos ir Amerikos klinikoje įrengta nauja moderni IVF (in vitro fertilization) laboratorija, kurioje atliekami visi pagrindiniai pagalbinio apvaisinimo būdai – IUI, IVF ir ICSI (esant reikalui ICSI su TESA).

   Tais pačiais 2007 m. Baltijos ir Amerikos klinikoje pradėti vitrifikuoti embrionai ir gauti pirmieji geri rezultatai – moterys pastojo ir pagimdė sveikus kūdikius.

   Minėtoje naujoje IVF laboratorijoje pirmaisiais metais (nuo 2007 m. kovo mėn.) buvo atliktos 35 IVF/ICSI procedūros. Po šių procedūrų (natūralus IVF ciklas) pastojo 11 moterų (pastojimo dažnis 31,4 proc.). Pažymėtina, kad jaunų moterų (iki 35 m.) pastojimo dažnis buvo 66,6 proc.: pastojo 8 iš 12 šio amžiaus moterų, 6 jų pagimdė sveikus kūdikius. Sveikų gimusių kūdikių dažnis nuo atliktų embriono patalpinimo procedūrų – 50 proc. 20 moterų buvo užšaldyti pertekliniai embrionai. Visi embrionai, įvertinus vitrifikacijos privalumus palyginti su lėtu šaldymu, buvo vitrifikuoti. Naudotas Vitrification Kit with Cryoleaf (MediCult, Danija,). Vėliau, esant nesėkmingai IVF procedūrai (gydymas nesibaigė nėštumu), 15 moterų buvo patalpinti atšildyti embrionai. 5 moterys (33,3 proc.), kurioms buvo patalpinti atšildyti embrionai, pastojo. 2008 metais gimė pirmasis sveikas kūdikis Lietuvoje po Baltijos ir Amerikos klinikoje IVF laboratorijoje atliktos embrionų vitrifikacijos. Šiuo metu Lietuvoje jau yra 5 tokie vaikeliai.

 Ateities perspektyvos

   Šiais laikais dauguma asmenų, būdami jauni, nori gyventi pilnavertį gyvenimą, siekti karjeros, mokslo aukštumų, o šeimos planavimą atideda vėlesniam laikotarpiui. Tuomet dažnai iškyla dilema – gimdyti kūdikį jauname amžiuje, ar atidėti tai vyresniam amžiui, rizikuojant su tuo susidurti su padidinta apsigimimų rizikos problema. Žinoma, kad apsigimimų rizika didėja su moters amžiumi.

   Pasaulyje rasta išeitis ir tokiais atvejais – siūloma užšaldyti moteriai jos kiaušialąstes ar kiaušidžių audinį, o vėliau, juos atšildžius, po atlikto apvaisinimo mėgintuvėlyje, susilaukti sveiko vaikelio, panaudojant savo pačios kiaušialąstes.

   Taip pat kiaušialąsčių ar kiaušidės audinio bei spermos šaldymas svarbus ir tuo atveju, jei, diagnozavus ankstyvųjų stadijų vėžį, žinoma, kad bus skiriama chemoterapija ar spindulinis gydymas. Vėliau, išgijus nuo vėžio ir norint susilaukti vaikų, galima naudoti savo paties ir nepažeistus medikamentų ir spindulių kiaušialąstes bei spermatozoidus. Tokie metodai ateityje ženkliai sumažins donorystės programų skaičių, kai dėl minėtų priežasčių porai prireikia donoro pagalbos.

   Taigi, poros, kurios renkasi embrionų vitrifikaciją, o ne lėtą šaldymą, turi didesnę tikimybę su 95% išgyvenamumo dažniu po embrionų atšildymo ir didesnę pastojimo tikimybę (iki 41,9 proc.) Po lėto užšaldymo ir atšildymo išgyvena apie 50,0 proc. embrionų (University of Michigan Comprehensive Cancer Center duomenys), o pastojimo dažnis siekia vos 13,5 proc. (Unita di Medicina Della Riproduzione, Fondazione HERA ir IVF tyrimo instititų Italijoje duomenys). Pagrindinė embrionų neišgyvenamumo problema po lėto užšaldymo ir atšildymo – ledo kristalų susiformavimas, o atšildant embrioną (ar kiaušialąstę) šie kristalai pažeidžia ląstelę. To neatsitinka vitrifikuojant, nes procesas įvyksta labai greitai, naudojami maži kiekiai, bet didelės krioprotektorių koncentracijos, ir ledo kristalai nesusiformuoja.

    Kiaušialąsčių šaldymas atliekamas nedažnai. Iki 2007 m. pasaulyje buvo vos 200 kūdikių, gimusių po tokių procedūrų. Taip pat pasulyje yra kuriami embrionų bankai. Užšaldyti embrionai laikomi ilgą laiką. Pora, susilaukusi kūdikio po IVF gali likusius embrionus išlaikyti ilgesniam laikui, o vėliau, kai jau jie vėl apsispręs turėti antrąjį ar trečiąjį vaikelį, gali būti patalpinti atšildyti embrionai. Tai ypač svarbu, jei pirmasis IVF ciklas atliktas virš 35 metų, o kito vaikelio pora planuoja susilaukti virš 40 metų.

 Apibendrinant, galima sakyti, kad vitrifikacija turi daug pranašumų, palyginti su lėtu šaldymu:

 1. Vitrifikacijos procesas yra paprastas ir greitas: trunka iki 10 min.

 2. Apsauga nuo ledo kristalų formavimosi vitrifikacijos proceso metu sėkmingai apsaugo ląsteles nuo pažeidimo, kas dažnai įvyksta lėto šaldymo metu.

 3. Procesas lengvai atliekamas ir valdomas: embrionai patalpinami į krioprotektorius, perkeliami ant šaldymo mentelės ir panardinami į skystą azotą.

 4. Vitrifikacijos metu galima tiesiogiai stebėti (po mikroskopu), kas vyksta su ląstelėmis.

 5. Vitrifikacijai nereikalinga papildoma brangiai kainuojanti šaldymo įranga, dėl to šis metodas yra ekonomiškai ženkliai efektyvesnis, palyginti su lėtu šaldymu.

Naudota literatūra:

01. Johnson, M. Essential Reproduction, 6th edn. Blackwell Scientific, 2007.

02. Edwards RG. Test tube babies. Nature. 1981,293,253–256.

03. Edwards RG and Steptoe PC. A Matter of Life. 1980, Hutchinson & Co., London.

04. Trounson A & Mohr L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature, 1983,305,707 – 709.
05. www.advancedfertility.com

06. Kuleshova L, Gianaroli L, Magli C, et al. Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report. Hum Reprod 1999,14,3077-9.

07. Al-Hasani S, Ozmen B, Koutlaki N, Schoepper B, Diedrich K, Schultze-Mosgau A. Three years of routine vitrification of human zygotes: is it still fair to advocate slow-rate freezing? eprod Biomed Online. 2007,14(3),288-93.

08. Youssry M, Ozmen B, Zohni K, Diedrich K, Al-Hasani S. Current aspects of blastocyst cryopreservation. Reprod Biomed Online. 2008,16(2),311-20.

09. Kuwayama M, Vajta G, Ieda S, et al. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination.

10. Reproductive BioMedicine Online 2005,11,608–14.
11. www.medicult.dk

12. Borini A, Bonu MA, Coticchio G, et al. Pregnancies and births after oocyte cryopreservation. Fertil Steril 2004,28,601-5.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas. Būtini laukeliai pažymėti *